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                  与Cas9的CtIP融合通过同源依赖性修复增强转基因整合

                  发表时间:2018-03-20 11:58 来源:四川大学

                  资料来源:

                  在此,我们提出了一种通过同源依赖修复( HDR )提高转基因整合效率的方法。CtIP是同源重组早期的关键蛋白,与Cas9融合,在人AAVS1安全港位点通过HDR刺激转基因整合。

                  典型的非同源末端连接( cNHEJ )和替代的末端连接途径,例如微同源性介导的末端连接( MMEJ ),在DNA末端经过处理后通过连接进行,并导致靶向但不精确的indes (通常是小的插入或缺失)。

                  CRISPR - Cas9系统极大地促进了基因组编辑。

                  两个或多个核苷酸的微同系物可以在通过切除DNA切割之后暴露,并且可以在MMEJ修复期间使用。与末端连接途径相反,使用外源DNA修复模板的同源依赖修复( HDR )支持精确的基因组编辑。典型地,可以使用与DSB侧翼序列具有同源性臂的转基因,因此转基因将被精确整合。

                  CtIP的最小N末端片段,被指定为HE作为HDR增强子,足以刺激HDR,这取决于CDK磷酸化位点和同源重组中CtIP活性所必需的多聚域。然而,Cas9 - HE对HDR的刺激依赖于所使用的导向RNA,这种限制可以通过对感兴趣位点的多个导向进行测试来克服。

                  对于CRISPR - Cas9,具有与靶DNA互补的间隔序列的引导RNA引导Cas9内切核酸酶8切割DNA。基因组序列的修饰发生在DSB修复过程中,起作用的分子途径决定了序列改变的类型。

                  介绍

                  为了提高人类发展报告中的基因组编辑,迄今为止已经开发了不同的策略。

                  Cas9 - HE融合使用简单,在包括人细胞系、iPS细胞和大鼠合子在内的几个实验系统中,与Cas9相比,可以获得两倍或更高效的转基因整合。

                  在哺乳动物细胞的先锋研究中,使用归巢内切核酸酶I - SceI在基因组中的独特位置引入DNA双链断裂( DSB ),允许通过同源重组1,2刺激基因靶向。随后,不同的人工序列特异性核酸酶,例如锌指核酸酶和TALE核酸酶,以及最近的CRISPR - Cas9核酸酶已经被用于靶向预定的基因组位点3、4、5、6、7。

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                  在使用CRISPR - Cas9进行基因组编辑时,转基因整合通常仍然具有挑战性。

                  https://www.nature.com/articles/s41467-018-03475-7

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